Das Lenti-Virusvektorsystem: Ein neuer Weg zur Bereitstellung genetischer Therapien

Das Lenti-Virusvektorsystem: Ein neuer Weg zur Bereitstellung genetischer Therapien

Ein neuer Weg zur Bereitstellung genetischer Therapien sorgt in der medizinischen Welt für Aufsehen. Das Lentivirus-Vektorsystem hat sich als wirksamer erwiesen als herkömmliche Methoden der Gen therapie. Dieses System nutzt einen Virus, um die therapeutischen Gene in die Körperzellen des Patienten zu transportieren. Forscher haben herausgefunden, dass diese Methode zu weniger Nebenwirkungen und höheren Erfolgsraten führt. In diesem Blogbeitrag werden wir das Lentivirus-Vektorsystem und seine Vorteile für Patienten mit genetischen Störungen diskutieren.  

Lentiviren


Zur Gattung der Lentiviren gehören Retroviren, die bei Menschen und anderen Säugetierarten anhaltende Krankheiten mit langen Inkubationszeiten verursachen. Zur Gattung gehört das Humane Immundefizienzvirus (HIV), das AIDS verursacht. Lentiviren integrieren eine große Menge viraler komplementärer DNA in die DNA der Wirtszelle, was es ihnen ermöglicht, sich nicht teilende Zellen leicht zu infizieren, was sie zu einem der effizientesten Gentransporter macht. Der Begriff „endogenes Retrovirus“ bezieht sich auf ein Virus, das seine DNA in das Keimbahngenom des Wirts integriert hat und es so zukünftigen Nachkommen des Wirts ermöglicht, sie zu erben. 

Lebenszyklus des Lentivirus


Der lentivirale Lebenszyklus umfasst eine Reihe von Schritten, die es dem Virus ermöglichen, in Zielzellen einzudringen, sein genetisches Material abzugeben und sich zu replizieren. Hier ist ein Überblick über die Hauptphasen im lentiviralen Lebenszyklus:


1. Anheftung und Eintritt: Der Prozess beginnt mit der Anheftung des Lentivirus an die Oberfläche der Zielzelle. Das Glykoprotein der Virushülle (normalerweise VSV-G oder andere modifizierte Proteine) interagiert mit spezifischen Rezeptoren auf der Zellmembran. Diese Anlagerung löst eine Konformationsänderung im Hüllprotein aus, wodurch ein Fusionspeptid freigelegt wird. Dadurch kann das Virus seine Hülle mit der Zellmembran verschmelzen und den Viruskern (der das RNA-Genom und essentielle Proteine ​​enthält) in das Zytoplasma der Zielzelle freisetzen.


2. Reverse Transkription: Sobald sich der Viruskern in der Zelle befindet, führt er eine umgekehrte Transkription durch. Das virale Enzym Reverse Transkriptase wandelt das einzelsträngige RNA-Genom des Virus in ein doppelsträngiges DNA-Zwischenprodukt um. Diese virale DNA, die sogenannte provirale DNA, integriert sich mit Hilfe des viralen Enzyms Integrase in die chromosomale DNA der Wirtszelle.


3. Integration: Die provirale DNA integriert sich an einer halbzufälligen Stelle in das Genom der Wirtszelle. Diese Integration wird durch Integrase katalysiert und ist für die Etablierung einer persistierenden Infektion durch das Virus unerlässlich. Die Integration kann zur Einfügung viraler DNA in die Nähe zellulärer Gene führen und möglicherweise deren Funktion beeinflussen.


4. Transkription und Translation: Integrierte provirale DNA dient als Matrize für die Transkription durch die RNA-Polymerase II der Wirtszelle. Virale RNA-Transkripte werden dann verarbeitet und übersetzt, um virale Struktur- und Enzymproteine ​​zu produzieren. Diese Proteine ​​spielen eine Rolle beim Zusammenbau neuer Viruspartikel.


5. Aufbau und Knospenbildung: Neu synthetisierte virale RNA wird zusammen mit den Struktur- und Enzymproteinen zur Zelloberfläche transportiert. Hier versammeln sie sich an der Plasmamembran und bilden neue Viruspartikel. Der virale Kern wird von der Wirtszellmembran umhüllt und nimmt die viralen Hüllproteine ​​auf, wenn er von der Zelloberfläche abknosst. Dieser Prozess ermöglicht es dem Virus, aus der Wirtszelle zu entkommen, ohne diese unbedingt zu zerstören.


6. Reifung und Freisetzung: Während oder kurz nach der Knospung durchlaufen die neu gebildeten Viruspartikel eine Reifung, bei der Proteaseenzyme die Vorläuferproteine ​​in ihre reifen Formen spalten. Dieser Schritt ist entscheidend für die Infektiosität der freigesetzten Viren. Das reife Lentivirus wird dann aus der Wirtszelle freigesetzt und kann andere Zellen infizieren, wodurch der Zyklus von neuem beginnt. 
Lebenszyklus des Lentivirus

Lentivirale Vektoren


Lentivirale Vektoren sind leistungsstarke Werkzeuge auf dem Gebiet der Genübertragung und werden aufgrund ihrer Fähigkeit, genetisches Material effizient in ein breites Spektrum sich teilender und nicht teilender Zellen einzuführen, häufig eingesetzt


Die für die Virusproduktion erforderlichen Komponenten sind auf viele Plasmide verteilt (3 für Systeme der zweiten Generation, 4 für Systeme der dritten Generation), um die Sicherheit des Lentivirus zu erhöhen. Um die Sicherheit zu verbessern, teilen lentivirale HIV-1-Vektoren der ersten Generation die Vektorkomponenten in drei Plasmide auf: (i) ein Verpackungskonstrukt; (ii) ein Env-Plasmid, das ein virales Glykoprotein enthält; und (iii) eine Transfervektor-Genomkonstruktion.


Um die Bildung von RCLs (replikationskompetenten Lentiviren) zu reduzieren, wurden die Verpackungs- und Hüllplasmide speziell ohne Verpackungssignal oder LTRs entwickelt. Das System der dritten Generation reduzierte effektiv die Bildung von RCLs und verbesserte die biologische Sicherheit.


Im Folgenden finden Sie eine Liste der Komponenten beider Systeme:


  •  Lentivirales Transferplasmid (enthält das Gen Ihres Interesses): Die Spendersequenz wird von langen terminalen Wiederholungen (LTRs) flankiert, die bei der Integration der Transferplasmid-DNA in das Wirtsgenom helfen. Im Allgemeinen sind es die Sequenzen zwischen und einschließlich der LTRs, die nach einer Virusinfektion in das Wirtsgenom eingebaut werden. Transferplasmide sind alle replikationsinkompetent und können eine zusätzliche Deletion im 3'LTR enthalten, wodurch das Virus aus Sicherheitsgründen nach der Integration „selbstinaktivierend“ (SIN) wird.
  •  Verpackungsplasmid: Dieses spezielle Plasmid enthält wichtige virale Gene, die für die Verpackung und Einkapselung des lentiviralen Genoms in virale Partikel erforderlich sind. Typischerweise trägt das Verpackungsplasmid Gene, die für die Strukturproteine ​​Gag und Pol kodieren, die für die Bildung viraler Kerne und die für die reverse Transkription und Integration erforderlichen enzymatischen Prozesse von entscheidender Bedeutung sind. Darüber hinaus enthält das Verpackungsplasmid häufig das Rev-Gen, das für die Regulierung des nuklearen Exports viraler RNA-Transkripte verantwortlich ist. Durch ein sorgfältig orchestriertes Zusammenspiel dieser Gene stellt das Verpackungsplasmid sicher, dass die genetische Ladung des lentiviralen Vektors präzise und effizient zu neuen Viruspartikeln zusammengesetzt wird.
  •  Hüllplasmid: Dieses spezialisierte Plasmid enthält das Gen, das für das virale Hüllglykoprotein kodiert, das die Wirtszellspezifität und den Eintrittsmechanismus des Lentivirus bestimmt. Durch die Bereitstellung des notwendigen Hüllproteins, das häufig aus Quellen wie dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV-G) stammt, ermöglicht das Hüllplasmid die Pseudotypisierung lentiviraler Partikel. Bei der Pseudotypisierung wird das native Hüllprotein durch das vom Hüllplasmid kodierte Protein ersetzt, wodurch das Spektrum der Zelltypen erweitert wird, die das Lentivirus infizieren kann. Dieser Prozess ist entscheidend für eine effiziente und spezifische Transduktion der gewünschten Zielzellen.


Das Hinzufügen von Genverpackungs- und Hüllplasmiden ist verallgemeinert und für verschiedene Zelltypen und Systeme geeignet. Bei der Planung Ihres Experiments ist das Transferplasmid die wichtige Komponente, die es zu berücksichtigen und zu optimieren gilt. Lentivirale Plasmide der 2. Generation nutzen den viralen LTR-Promotor für die Genexpression, während Transferplasmide der 3. Generation einen Hybrid-LTR-Promotor nutzen. In einem Transferplasmid können auch zusätzliche oder spezialisierte Promotoren enthalten sein: Beispielsweise ist der U6-Promotor im pSico-Plasmid enthalten, um die shRNA-Expression voranzutreiben. Andere Merkmale wie fluoreszierende Fusionen oder Reporter können ebenfalls in Transferplasmide einbezogen werden.


Ziel des Einsatzes von drei Varianten des lentiviralen Gentransfers ist es, Forschern eine alternative Methode für eine effiziente Produktion in vitro oder im Tiermodell zur Verfügung zu stellen. Mit der Entdeckung des Lentivirus eröffneten sich 2012 neue Möglichkeiten für die Humangenomikforschung. Forscher versuchen, Lentiviren zu nutzen, um mithilfe der RNA-Interferenztechnologie in Hochdurchsatzverfahren ein bestimmtes Gen zum Schweigen zu bringen, was zu erheblichen Verbesserungen der Effizienz und Kosteneffizienz führt.

Lentivirale Gentherapie


Das Lentivirus-Vektorsystem ist eine neue Möglichkeit zur Bereitstellung genetischer Therapien. Dieses System verwendet ein Lentivirus, um die therapeutischen Gene in die Körperzellen des Patienten zu transportieren. Lentiviren sind für ihre Fähigkeit bekannt, ein breites Spektrum an Zellen zu infizieren, was sie zu einer idealen Wahl für die Genübertragung macht. Darüber hinaus sind Lentiviren sehr stabil und können über lange Zeiträume im Körper verbleiben. Dies macht sie zu einer hervorragenden Wahl für Patienten mit chronischen Erkrankungen. Diese Eigenschaft von Lentivirus-Vektoren, eine starke Transduktion und stabile Expression in sich teilende und sich nicht teilende Zellen sowohl in vitro als auch in vivo zu vermitteln, ist äußerst vorteilhaft.


Einer der Vorteile der Verwendung von Lentiviren als Vektoren besteht darin, dass sie sehr sicher sind. Sie haben auch ein geringes Risiko, bei Patienten Nebenwirkungen hervorzurufen. Darüber hinaus können Lentiviren bei Bedarf problemlos aus dem Körper ausgeschieden werden.

Lentivirales System – Anwendungen


  •  Die Verwendung eines Lentivirus zur Einführung eines neuen Gens in menschliche oder tierische Zellen ist eine weitere beliebte Technik. Beispielsweise kann das Modell der Maus-Hämophilie, die den Wildtyp-Plättchenfaktor VIII exprimiert, das defekte Gen beim Menschen, mit dieser Methode korrigiert werden. Da eine lentivirale Infektion sich teilende und sich nicht teilende Zellen effizient infizieren kann, bietet sie gegenüber anderen Gentherapietechniken mehrere Vorteile, wie z. B. eine lange Expression des Transgens und eine geringe Immunogenität. Darüber hinaus können Lenti-Viren bestimmte Zellen im Körper angreifen und so dafür sorgen, dass die therapeutischen Gene ihren Bestimmungsort erreichen.
  •  Lentiviren wurden auch verwendet, um eine Immun antwort gegen Tumorantigene auszulösen. Gammaretroviren und Lentiviren wurden bereits in mehr als 300 klinischen Studien eingesetzt, wobei die Anwendungen von therapeutischen Optionen für verschiedene Krankheiten bis hin zu Impfstoffen reichen.
  •  Das Lentivirus-Vektorsystem bietet mehrere Vorteile für Menschen, die an genetischen Erkrankungen leiden. Diese Methode ist sowohl sicher als auch effektiv. Darüber hinaus können Lentiviren zur Abgabe verschiedener therapeutischer Gene genutzt werden.
  •  Diese Vektoren sind bei vielen Arten hocheffizient. Die DNA-Mikroinjektion war bei Hühnern völlig wirkungslos. Die Fremd-DNA in diesen Vektoren ist auf 8 kB begrenzt. Um eine große Anzahl transgener Tiere mit einer begrenzten Anzahl einzigartiger integrierter Kopien zu produzieren, muss die Menge des verwendeten Vektors geändert werden. Die lentiviralen Vektoren und das Transgen werden gemeinsam zum Schweigen gebracht. Jede integrierte Kopie ist anders. Der Isolator 5′ HS4 reduziert den Schalldämpfungseffekt. Der virale Promotor bestimmt typischerweise die Expression lentiviraler Vektoren. Die lentiviralen Vektoren eignen sich hervorragend zur Herstellung von siRNAs. Diese Vektoren sind im Handel erhältlich und die Banken umfassen Vektoren, die siRNA-Gene enthalten, die sowohl auf mRNAs von Menschen als auch von Mäusen abzielen.

Lentivirale Vektoren als Gentransferinstrument ins ZNS


Die lentiviralen Vektoren werden als Gentransfervehikel für das Gehirn eingesetzt, da sie die meisten Zelltypen im Gehirn transduzieren, was zu einer robusten und langanhaltenden Genexpression führt.


Es wurde festgestellt, dass lentivirale Vektoren im Vergleich zu Gamma-Retroviren weniger gefährlich sind.


Mehrere Untersuchungen haben gezeigt, dass lentivirale Vektoren die meisten Zelltypen im ZNS, einschließlich terminal differenzierter Neuronen, dendritischer Zellen, Gliazellen, Astrozyten und Oligodendrozyten, in vivo effizient transduzieren können.


Obwohl gezeigt wurde, dass andere Arten lentiviraler Vektoren wie SIV, EIAV und FIV Transgene in das Gehirn senden, haben sich HIV-1-basierte Vektoren als die erfolgreichsten und effizientesten erwiesen. 

Lentivirale Gentherapie – Mögliche Risiken 


Während lentivirale Vektoren zahlreiche Vorteile für die Gentherapie bieten, sind mit ihrem Einsatz auch gewisse Risiken verbunden. Diese Risiken ergeben sich in erster Linie aus der viralen Herkunft des Vektors und seinen möglichen Wechselwirkungen mit dem Wirtsorganismus. Zu den Hauptrisiken gehören:


1. Insertionsmutagenese: Lentivirale Vektoren integrieren ihre genetische Ladung in das Genom der Wirtszelle. In einigen Fällen kann diese Integration die normale zelluläre Genfunktion stören, was möglicherweise zu einer Insertionsmutagenese führt und unbeabsichtigte Folgen hat, wie z. B. die Aktivierung von Onkogenen oder die Bildung von Tumoren.


2. Immunogenität: Obwohl lentivirale Vektoren im Allgemeinen weniger immunogen sind als einige andere virale Vektoren, können sie dennoch eine Immunantwort im Wirt auslösen. Diese Immunantwort könnte die Wirksamkeit der Gentherapie einschränken oder zu Nebenwirkungen führen.


3. Begrenzte Kontrolle der Expression: Während lentivirale Vektoren eine stabile und langfristige Genexpression bieten, kann die Kontrolle des Ausmaßes und des Zeitpunkts der Expression eine Herausforderung darstellen. Eine Überexpression oder Unterexpression des therapeutischen Gens könnte zu unerwünschten Wirkungen oder suboptimalen Behandlungsergebnissen führen.


4. Off-Target-Effekte: Lentivirale Vektoren könnten sich unbeabsichtigt in unbeabsichtigte genomische Stellen integrieren und möglicherweise die Funktion benachbarter Gene beeinträchtigen. Dies könnte zu unvorhergesehenen biologischen Folgen oder Sicherheitsproblemen führen.


5. Risiko der Vektormobilisierung: In einigen Fällen könnten verbleibende virale Elemente im lentiviralen Vektorsystem zur Erzeugung replikationskompetenter Lentiviren (RCLs) führen, die das Potenzial haben, sich zu replizieren und Schaden anzurichten. Um dieses Risiko zu mindern, sind strenge Qualitätskontrollen und Sicherheitsmaßnahmen erforderlich.


6. Entzündungsreaktionen: Obwohl lentivirale Vektoren im Allgemeinen als weniger entzündlich gelten als andere virale Vektoren, können sie dennoch leichte Immunreaktionen auslösen. Diese Reaktionen könnten zu Entzündungen an der Injektionsstelle oder im umliegenden Gewebe führen.


7. Ethische Überlegungen: Der Einsatz lentiviraler Vektoren in der Gentherapie wirft ethische Fragen auf, insbesondere wenn es um Keimbahnbearbeitung oder dauerhafte genetische Veränderungen geht, die an zukünftige Generationen weitergegeben werden könnten.


8. Einschränkungen des Tropismus: Lentivirale Vektoren transduzieren möglicherweise nicht alle Zelltypen effizient, was ihre Anwendbarkeit für bestimmte Krankheiten oder Therapien, die ein spezifisches Zell-Targeting erfordern, einschränken könnte.


9. Herausforderungen bei der Herstellung: Die Produktion hochwertiger lentiviraler Vektoren für den klinischen Einsatz kann komplex und kostspielig sein. Die Sicherstellung konsistenter Vektorproduktions- und -reinigungsprozesse ist für Sicherheit und Wirksamkeit von entscheidender Bedeutung.


10. Regulatorische Überlegungen: Die Verwendung lentiviraler Vektoren für die Gentherapie unterliegt der behördlichen Aufsicht und der Genehmigungsprozess kann streng und zeitaufwändig sein. Die Einhaltung regulatorischer Anforderungen ist ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung und Umsetzung lentiviraler Therapien.


Um diese Risiken zu mindern, sind gründliche präklinische Studien, fundierte Sicherheitsbewertungen und eine sorgfältige Patientenüberwachung unerlässlich. Forscher und Kliniker müssen kontinuierlich daran arbeiten, das Sicherheitsprofil lentiviraler Gentherapien zu verbessern und potenzielle Herausforderungen anzugehen, um ihren Nutzen zu maximieren und gleichzeitig potenzielle Risiken zu minimieren. 
9th Sep 2024 Shanza Riaz

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