3D-Zellkultur: Assay-Leitfaden

Verweise


Wichtige Punkte


  • Dreidimensionale (3D) Zellkulturen sind künstlich geschaffene Umgebungen, in denen Zellen wachsen oder auf 3D-Art mit ihrer Umgebung interagieren können.
  • Die 3D-Zellkultur ähnelt eher den physiologischen Bedingungen und kann einen besseren Indikator für den Erfolg in vivo liefern. Es gibt Tests und Kits, die bei der Kultivierung und Quantifizierung von 3D-Zellkulturen helfen können. 

Inhalt


Hintergrund


Was ist 3D-Zellkultur?
Vor-und Nachteile


Anbau
Basalmembranmatrix
Alginat-Hydrogel


Untersuchungen
Ernteset                                         XTT
3D-Lebensfähigkeitstest            WST-1
LDH und Adenylatkinase           WST-8 

Hintergrund


Was ist 3D-Zellkultur?


Von allen Kultivierungsmodellen, die heute in der Arzneimittelforschung eingesetzt werden, hat sich keines im Bereich der Krebsforschung als vielversprechender erwiesen als dreidimensionale Zellkulturmodelle. Insbesondere bei der Untersuchung von Krebszellen können Tumorsphäroide, die aus Zellaggregaten bestehen, ein bemerkenswertes Instrument sein, um die In-vivo-Wirksamkeit von Interventionen besser zu beurteilen, bevor sie zu Versuchen an nichtmenschlichen Tieren übergehen. Eine Studie über Brustkrebs aus dem Jahr 2014 ist ein eindrucksvolles Beispiel dafür, wie solche Kultivierungstechniken die heterogene Tumormikroumgebung modellieren können.
Bei der 3D-Zellkultur werden Zellen in drei Dimensionen kultiviert, wobei Strukturen wie Sphäroide in einer Umgebung entstehen, die die räumliche Nutzung in vivo nachahmt. Im Gegensatz zur Praxis der 2D-Zellkultur, bei der normalerweise Zellen in einer Monoschicht auf Platten gezüchtet werden, erleichtert die 3D-Zellkultur das Wachstum, indem sie eine weitere Achse für Expansion und Interaktion hinzufügt.
Bei Krankheiten wie Krebs ist die Wiederherstellung der richtigen Mikroumgebung wichtig für die Beurteilung der tatsächlichen Wirksamkeit von Medikamenten und anderen Interventionsmethoden (Quelle). In einer 2D-Kulturumgebung haben Zellen nicht die gleiche Kommunikation mit ihren umgebenden Nachbarn oder mit der extrazellulären Matrix. In einer 3D-Umgebung können diese Interaktionen einfacher modelliert und zuverlässiger untersucht werden.
3D-Zellkulturen verbessern die Funktion, Differenzierung und Lebensfähigkeit von Zellen und erfassen die Mikroumgebung besser als herkömmliche 2D-Zellkulturen. 3D-Matrizen bieten eine physiologisch relevante Screening-Plattform, indem sie In-vivo-Reaktionen für viele Zelltypen, einschließlich Krebs und Stammzellen, in Entwicklungsmorphogenese-, Pharmakologie-, Arzneimittelstoffwechsel- und Arzneimitteltoxizitätsstudien nachahmen. 

Pros and Cons of 3D Cell Culture


Vorteile 
Nachteile 
Imitieren die In-vivo-Bedingungen besser 
Mangel an zuverlässigen, verifizierten Tests 
Besserer Indikator für den Erfolg in
präklinischen und Tierversuchen 
Geringe Zuverlässigkeit von Charge zu Charge 
Physiologisch relevantes Screening-Profil für
neuartige Interventionen 
Es ist schwierig, die Lebensfähigkeit zu
beurteilen, ohne das 3D-Zellkulturmodell zu zerstören 
Wie oben gezeigt, besteht ein großer Vorteil der Verwendung von 3D-Zellkulturen darin, dass sie ein besseres Modell für In-vivo-Gewebeumgebungen und -interaktionen darstellen.


Ein großer Nachteil der Verwendung der 3D-Zellkultur war bisher das Fehlen zuverlässiger Tests und die Tatsache, dass die vorhandenen Tests die Zerstörung des untersuchten Organoids oder der untersuchten Struktur erforderten. Die Nachteile der Verwendung von 3D-Zellkulturen wurden jedoch durch die Entwicklung und Verwendung neuer, verbesserter Kultivierungsmethoden und -tests behoben. Ebenso wurde das Problem der geringen Variabilität von Charge zu Charge durch zusätzliche Funktionen in Gerüsten und Matrizen sowie durch neue Studien behoben, die die Validierung dieser Verfahren belegen (Quelle). 

Anbau


Basalmembranmatrix


Die Basalmembran ist eine faserige extrazelluläre Matrix, die bei Säugetieren als Grenze und Adhäsionsplattform dient. Unser 3D-Zellkulturmatrix-BME-Kit enthält eine Basalmembranmatrix und einen Waschpuffer, um die Kultivierung und Messung des 3D-Sphäroidwachstums zu ermöglichen. Unser gebrauchsfertiges 3D-Zellkultur-Scaffold-Komplettset enthält eine enzymfreie Gerüstdissoziationslösung, Neutralisierungspuffer und gebrauchsfertige Gerüste in einer 96-Well-Plattenform. 

Alginat-Hydrogel


Alginat-Hydrogel kann für die Kultivierung von Pflanzenzellen in ähnlicher Weise verwendet werden wie die BME-Matrix für Säugetiere. Unser 3D-Zellkultur-Matrix-Alginat-Hydrogel-Kit (siehe Abbildung unten) enthält Materialien, die zur Schaffung eines dreidimensionalen Sphäroidwachstums für Pflanzenzellen verwendet werden können. Es ist auch mit dem 3D Cell Culture Ready-to-Use Scaffold Complete Kit kompatibel. 
Abb. 1. Wachstum von HepG2-Zellen und MCF7-Zellen ohne Matrix im Vergleich zu einem Matrixgerüst. Bei der Calcein-AM-Färbung wurde festgestellt, dass die Lebensfähigkeit der Zellen auch während einer langfristigen Matrixkultivierung nicht beeinträchtigt war.
Abb. 1. Wachstum von HepG2-Zellen und MCF7-Zellen ohne Matrix im Vergleich zu einem Matrixgerüst. Bei der Calcein-AM-Färbung wurde festgestellt, dass die Lebensfähigkeit der Zellen auch während einer langfristigen Matrixkultivierung nicht beeinträchtigt war. 

3D-Zellkultur-Assays


1. 3D-Ernteset
2. 3D-Lebensfähigkeitstest
3. Adenylatkinase
4. Laktatdehydrogenase
5. XTT
6. WST1
7. WST8 (bald verfügbar) 

3D-Ernteset


Unser 3D-Zellkultur-Kit zur nicht-enzymatischen Zellernte ist eine ideale Lösung für die Isolierung von Zellen und Sphäroiden aus Matrizen. Im Gegensatz zu Trypsin und Accutase – zwei häufig verwendeten Proteasen für den Matrixabbau – ist die in diesem Assay verwendete sanfte Lösung auf Kochsalzlösung ideal für Zellen, die möglicherweise empfindlich auf den Proteaseverdau reagieren. Dies ist ein wichtiger Faktor, wenn die kultivierten Zellen anhand von Zelloberflächenproteinen oder Signalen beurteilt werden sollen, da Proteasen ein höheres Potenzial haben, diese Prozesse zu schädigen und solche physiologischen Beurteilungen zu verändern. Unsere salzbasierte Lösung ist für die vollständige Dissoziation von Matrizen optimiert und standardisiert, insbesondere von Matrizen aus unseren eigenen Zellkultur-Kits.


Die Isolierung von Zellen und Sphäroiden aus ihrer Matrix ist ein wichtiger Schritt bei der endgültigen Beurteilung der Zellpassage, biochemischer Prozesse oder der Proteinanalyse. Die Verwendung dieses Kits ermöglicht die Isolierung dieser Zellen mit hoher Lebensfähigkeit für die anschließende biochemische, protein- und zellbasierte Analyse. 

3D-Lebensfähigkeitstest


Der Test des 3D Cell Culture HTS Cell Viability Assay Kit verwendet sanfte, nicht radioaktive, nicht enzymatische Methoden, um die Lebensfähigkeit einer Probe zu testen. Dieses Assay-Kit bietet eine schnelle, benutzerfreundliche Hochdurchsatz-Screeningmethode zur Charakterisierung und zum Screening der Lebensfähigkeit, Zytotoxizität und Apoptose von Zellen. Unser Kit bietet eine standardisierte fluorometrische Methode zur empfindlichen Quantifizierung von Zellen, mit der nur fünfzig lebensfähige Zellen in einer Vertiefung nachgewiesen werden können. Es eignet sich zur Beurteilung der Zellproliferation, der Zelllebensfähigkeit, der Chemotaxis, der Zytotoxizität und der Apoptose. Das Kit enthält eine Kochsalzlösung zur Matrixdissoziation, Puffer für den Lebensfähigkeitstest sowie Calcein AM und ist mit allen Zelltypen von Säugetieren kompatibel.


Sobald sich Matrix und Sphäroid von der 3D-Kultur lösen, kann das Zellwachstum beurteilt werden. Ebenso ermöglicht das Kit die Messung der Zelllebensfähigkeit als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, Zytokine, Mitogene und Nährstoffe. Die Wirkung von zytotoxischen oder zytostatischen Verbindungen – wie Krebsmedikamenten, toxischen Wirkstoffen oder anderen Arzneimitteln, die das Zellwachstum oder die Sphäroidbildung beeinflussen können – kann gemessen werden. 

Adenylatkinase (AK)


Adenylatkinase ist ein allgegenwärtiges Protein, das in der Plasmamembran aller eukaryontischen und prokaryontischen Zellen vorhanden ist. Bei einer Beschädigung der Membran wird dieses Protein in das Kulturmedium freigesetzt. Somit ist AK ein aussagekräftiger Indikator für Zytotoxizität und kann auch als Proxy für die Messung der Lebensfähigkeit verwendet werden.


Das GenieGlow Cytotoxicity Assay Kit ist ein schneller und empfindlicher Assay zur Messung der Zelllebensfähigkeit in einem dreidimensionalen Modell in Kombination mit dem 3D Cell Culture Non-Enzymatic Cell Harvesting Kit. 

Laktatdehydrogenase (LDH)


Laktatdehydrogenase (LDH) ist ein stabiles Enzym, das bei Schädigung der Plasmamembran schnell in das Zellkulturmedium freigesetzt wird. Es kommt in allen Zelltypen vor und ist daher ein starker Indikator für Zytotoxizität. Eine gut charakterisierte Methode zur Beurteilung der Zytotoxizität in 3D-Zellkulturen besteht darin, einfach das vorhandene Medium zu entfernen und den Test auf einer 96-Well-Platte durchzuführen.


Unser Hochdurchsatz-LDH-Zytotoxizitätstest eignet sich zur Schätzung der Biomasse, zur Zellzählung und zur Bestimmung der Gesundheit von Zellen und Geweben. LDH wird häufig für Zytotoxizitätstests in kultivierten Zellen sowie für Lebensfähigkeitstests verwendet. 

XTT


XTT-Zellproliferationstests verwenden das wasserlösliche gelbe Tetrazoliumsalz XTT, um die zelluläre Stoffwechselaktivität zu erfassen. Während des Tests wird gelbes XTT durch Dehydrogenase-Enzyme in metabolisch aktiven Zellen zu einem stark gefärbten Formazan-Farbstoff reduziert. Da diese Umwandlung nur in lebensfähigen Zellen stattfindet, ist die Menge des produzierten Formazans proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen in einer Probe. Der im Assay erzeugte Formazan-Farbstoff ist in wässrigen Lösungen löslich und wird durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Spektrophotometer quantifiziert. Letztendlich ist die Farbstoffabsorption proportional zur Anzahl der metabolisch aktiven, lebensfähigen Zellen in jeder Vertiefung. (Quelle)


Unser XTT-Zellproliferations-Assay-Kit ist für Assays mit hohem Durchsatz optimiert und erfordert kein Waschen oder andere Schritte, die zu Zellverlust oder -variabilität führen könnten. Unser Kit ist nicht radioaktiv und eignet sich ideal für die Quantifizierung der Zellproliferation und Lebensfähigkeit als Reaktion auf pharmazeutische, chemische, ernährungsbedingte und umweltbedingte Eingriffe. 

WST-1


WST-1 ist eine Verbindung zur kolorimetrischen Beurteilung der Lebensfähigkeit von Zellen. Dieses Reagenz bietet eine einfache und genaue Methode zur Messung der Zellproliferation, die auf der Spaltung des Tetrazoliumsalzes WST-1 zu Formazan durch zelluläre mitochondriale Dehydrogenasen basiert.


Die Vergrößerung der Anzahl lebensfähiger Zellen führt zu einer Erhöhung der Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen, was zu einer Erhöhung der Menge an gebildetem Formazanfarbstoff führt. Der von lebensfähigen Zellen produzierte Formazanfarbstoff kann durch Messung der Absorption bei 440 nm quantifiziert werden. Diese Methode ist nicht radioaktiv, schnell und empfindlicher als MTT-, XTT- oder MTS-basierte Tests.


Derzeit ist WST-1 der empfindlichste verfügbare Test für die Lebensfähigkeit. Lesen Sie hier mehr über unser Protokoll zum WST-1-Zellproliferationsreagenz. Der Assay kann in derselben Mikrotiterplatte durchgeführt werden und erfordert keine zusätzlichen Schritte (Waschen, Ernten, Zellsolubilisierung usw.). 

WST-8


WST-8 (auch CCK-8 genannt) ist die neueste und am weitesten entwickelte Form der Lebensfähigkeitsprüfung. Es hat sich kürzlich als deutlich weniger toxisch erwiesen als seine Vorgänger MTT, XTT und WST-1. (Vollständiger Artikel hier) Da es sich bei WST-8 um einen Test handelt, der extrazellulär funktioniert, ist er funktionell ungiftig. WST-8-Tetrazoliumsalz wird durch zelluläre Dehydrogenasen zu einem orangefarbenen Formazanprodukt reduziert, das im Gewebekulturmedium löslich ist. Anschließend kann Formazan mit einem Spektralphotometer gemessen werden, um den Anteil der Zellen zu bestimmen, die stoffwechselaktiv und damit lebensfähig sind.


Nach Abschluss des Assays können die Zellen gewaschen und in Monoschichtform wiederverwendet werden. 

3D-Lebensfähigkeit respiratorischer Organoidzellen in einem Hochdurchsatz-384-Well-Plattentest (AKES081)


Technische Anmerkung von Dr. Elodie Alessandri-Gradt1


Einführung


Atemwegsinfektionen sind die vierthäufigste Todesursache weltweit und werden hauptsächlich durch Virusinfektionen verursacht. Apikale respiratorische Organoide sind innovative 3D-Modelle, die das menschliche respiratorische Epithel nachahmen2. Sie können für verschiedene Anwendungen im Bereich der medizinischen Virologie eingesetzt werden, darunter die Analyse des Viruseintritts, der Virulenz, der Zellpathogenese, der Arzneimittelsicherheit, der Immunantwort und sogar Hochdurchsatzstudien zum Arzneimittelscreening.
Aufgrund der komplexen Natur von Organoiden und 3D-Modellen mangelt es jedoch nach wie vor an Reagenzien, mit denen sich Zellproliferation, Lebensfähigkeit und Zytotoxizität in diesen Strukturen genau messen lassen. In dieser Studie zeigen wir, dass der Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay ein hervorragendes Reagenz zur Messung der Zelllebensfähigkeit in 3D-Atmungsorganoiden in einem Hochdurchsatz-384-Well-Format ist und weitaus bessere Ergebnisse als andere führende Reagenzien liefert. 

Testprinzip


Der Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay ist ein hochempfindliches, einstufiges Kit zur Quantifizierung der Anzahl lebender lebensfähiger Zellen direkt in Zellkulturüberständen und 3D-Organoidmodellen. Dieses Kit ist eine ausgezeichnete Wahl für Proliferations- und Zytotoxizitätsstudien und wurde in 2D-Zellkulturen sowie Apical-Out-Atemwegsorganoiden in einem 384-Well-Format mit hohem Durchsatz validiert. Diese Technologie basiert auf der Reduktion von WST-8-Tetrazoliumsalz durch mitochondriale Dehydrogenasen zu einem orangefarbenen Produkt, das bei Messung bei 450 nm direkt proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen ist. WST-8 ist in Zellkulturmedien gut löslich, weist ein niedriges Zytotoxizitätsprofil auf und kann ohne Vorbehandlungen oder Waschschritte direkt zu kultivierten Zellen gegeben werden. Es ist äußerst leistungsstark für hohen Durchsatz und
empfindliche Experimente, insbesondere solche, die längere Inkubationsschritte wie 24 Stunden oder 48 Stunden erfordern. Dieses Kit bietet eine viel höhere Empfindlichkeit und geringere Zytotoxizität als andere Tetrazolium-Reagenzien wie MTS, MTT, PrestoBlue oder XTT. 

Materialien und Methoden


Multimode-Leser
384-w dunkler Teller mit klarem Boden Corning®
DMSO (Sigma) 

Protokoll


- 75 bis 100/Well selbstgemachte apikale Organoide wurden in dreifacher Ausfertigung in eine 384-W-Platte gegeben
- 0,1 % und 10 % DMSO wurden als negative und positive Kontrollen in einem Endvolumen von 50 μl hinzugefügt
- Die Platte wurde 2 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert
- 5 μl 3D Organoid Cell Viability Assay CCK8-Puffer oder Prestoblue-Reagenz wurden in jede Vertiefung gegeben und
entweder 1 Stunde, 3 Stunden oder über Nacht inkubiert
- Die Absorption der Vertiefungen, die den 3D Organoid Cell Viability Assay CCK-8-Puffer enthielten, betrug
gemessen bei 490 nm, während diejenigen, die PrestoBlue-Reagenz enthielten, bei ex 535 nm/em 595 nm gemessen wurden
- Die Lebensfähigkeit der Zellen (%) wurde aus OD-Probe, Kontrolle und Leerwert berechnet. 

Ergebnisse & Diskussionen


Tabelle 1: Mit Spectra erhaltenes Datenblatt.
Tabelle 1: Mit Spectra erhaltenes Datenblatt.  
Tabelle 1: Mit Spectra erhaltenes Datenblatt.
A) 3D Apical-Out-Organoide wurden mit 0,1 % DMSO behandelt und die Zelllebensfähigkeit entweder mit dem Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay oder dem ThermoScientific PrestoBlue-Reagenz nach 1-stündiger, 3-stündiger und über Nacht erfolgender Inkubation gemessen. Die mit dem 3D Organoid Cell Viability Assay an den Organoiden ermittelte Lebensfähigkeit lag zu allen Zeitpunkten über 100 % im Vergleich zu einer verringerten Lebensfähigkeit bei Verwendung des PrestoBlue-Reagenzes.
B) Apikal nach außen gerichtete 3D-Organoide wurden mit 10 % DMSO behandelt, um den Zelltod einzuleiten, und die Lebensfähigkeit wurde entweder mit dem Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay oder dem ThermoScientific PrestoBlue-Reagenz nach 1-stündiger, 3-stündiger und über Nacht erfolgender Inkubation gemessen. Zelle
Die mit dem 3D Organoid Cell Viability Assay an den Organoiden ermittelte Lebensfähigkeit verringerte sich um 0,5 % bis 5,9 %. 

Abschluss


Der 3D Organoid Cell Viability Assay lieferte im Vergleich zu einer anderen auf Resazurin basierenden Methode hervorragende Ergebnisse für die Lebensfähigkeit von 3D-Organoidzellen in den apikalen Atemwegen. 

Verweise


1. Abteilung für Virologie DYNAMICURE INSERM UMR 1311, UNIRouen, UNICAEN
2. Stroulios G, Brown T, Moreni G, et al. Apikale Atemwegsorganoide als Plattform für die Untersuchung viraler Infektionen und das Screening auf antivirale Medikamente. Sci Rep. 2022;12(x1):7673. Veröffentlicht am 10. Mai 2022. doi:10.1038/s41598-022-11700-z 
6th Aug 2024 Shanza Riaz

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